濁度法測定硫酸小諾霉素效價(jià)的方法

來(lái)源：http://www.thesierramadre.com/ 作者：余氯檢測儀 時(shí)間：2019-01-04

　　[摘要] 目的:建立濁度法測定硫酸小諾霉素效價(jià)的方法。方法:采用濁度法測定硫酸小諾霉素的效價(jià),并將濁度法與管碟法測定結果相比較。

　　結果:濁度法與管碟法測定結果一致,濁度法測定結果可信限率較低。結論:本法簡(jiǎn)便、快捷,可用于硫酸小諾霉素的效價(jià)測定。

　　[關(guān)鍵詞] 濁度法;硫酸小諾霉素;效價(jià);管碟法

　　硫酸小諾霉素為廣譜氨基糖苷類(lèi)抗生素,耳毒性和腎毒性較低,對6-N-乙酰酯酶抗藥性菌有效,有強大和快速的抗菌能力,在治療由革蘭陰性菌如銅綠假細胞菌、大腸埃希菌等引起的感染時(shí),與內酰胺類(lèi)抗生素有協(xié)同作用。目前該藥物及其制劑采用管碟法作為含量測定的方法,但管碟法為傳統方法,雖能直觀(guān)反映其體外抗菌能力,但是管碟法進(jìn)行過(guò)程中影響因素頗多,而且消耗人力大,花費時(shí)間長(cháng);濁度法既能彌補這些缺點(diǎn),又具有測定結果精密度高。本研究建立濁度法測定硫酸小諾霉素效價(jià)的方法,即可直觀(guān)反映藥物的抗菌活性,又可在檢測當天獲得結果,靈敏、快速,可作為硫酸小諾霉素效價(jià)的測定方法[1]。

　　1 儀器與試藥

　　1.1 儀器

　　抑菌圈測量分析儀ZY-300IV型、微生物比濁法測定儀WBS-100型(北京先驅威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司);BP-211D分析天平(SARTORIUS公司);UV-2401型紫外分光光度計(日本島津)。

　　1.2 試藥

　　大腸埃希菌[CMCC(B)44103];硫酸小諾霉素標準品(批號:130342-200703,效價(jià):574 U/mg);培養基Ⅲ(批號:060403,中國藥品生物制品檢定所);硫酸小諾霉素原料藥(山西省侯馬市平陽(yáng)制藥廠(chǎng));氯化鈉,磷酸氫二鉀,磷酸二氫鉀,均為分析純。

　　2 方法與結果

　　2.1 實(shí)驗條件

　　2.1.1 大腸埃希菌懸液的制備取大腸埃希菌[CMCC(B)44103]的營(yíng)養瓊脂斜面培養物,接種于營(yíng)養瓊脂斜面上,在35～37℃培養20～22 h,然后用滅菌水將菌苔洗下,并加滅菌水稀釋,使其在580 nm波長(cháng)處的吸收度為1.0。

　　2.1.2 試驗菌懸液加入量的選擇 取大腸埃希菌懸液,加入到培養基中,制成含菌濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的培養基,培養2.5 h,在580 nm處測定吸收度,結果含3%菌液濃度在3%時(shí),吸收度為0.52,符合要求,故選3%的菌液濃度。

　　2.1.3 抗生素溶液配制精密稱(chēng)取標準品和原料藥適量,加滅菌水溶解,配制成1 000 U/mg的溶液,精密量取此溶液適量,用滅菌磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)稀釋至最終濃度為10 U/mg和20 U/mg(劑間比為1∶2)。

　　2.1.4 抗生素溶液的分裝 取已滅菌的石英比色管16支,分別為ds14支、ds24支、dT14支、dT24支,分別標記,精密量取標準溶液ds1、ds2及dT1、dT2各1.0 ml,按編號加入相應比色管中。

　　2.1.5 含菌培養基的分裝在培養基中加入一定量試驗菌(3%),用已滅菌的刻度吸管分裝至比色管中,每管分裝9.0 ml,立即振搖,混合均勻。

　　2.1.6 培養、測量與計算使用WBS-100微生物比濁儀,恒溫培養,定時(shí)振蕩,在線(xiàn)測量,計算結果[2]。

　　2.2 線(xiàn)性范圍考察

　　稱(chēng)取標準品適量,加滅菌水制成1 000 U/mg的溶液,分別精密吸取此液適量,用滅菌磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)稀釋成8、10、12、16、20、24、30、35、40 U/mg的溶液。分別精密量取上述各溶液1.0 ml,置滅菌比色皿中,每個(gè)濃度3管,分別加入含菌培養基9.0 ml,立即搖勻,在濁度測定儀中培養3.5 h,以培養基為空白,在580 nm處測定吸收值,以吸收值(A)為縱坐標,以濃度(C)的對數為橫坐標,進(jìn)行線(xiàn)性回歸,回歸方程為Y=2.634 2-1.294 6lgC(r=0.998 2),說(shuō)明在40～80 U/mg濃度范圍內,抗生素濃度的對數與吸收值線(xiàn)性關(guān)系良好[3]。在線(xiàn)性濃度范圍內選取硫酸小諾霉素的高低劑量在24、12 U/mg所測定的A值基本在0.4～0.6范圍內,高低計量為2∶1,可作為效價(jià)測定的抗生素溶液濃度。培養基接種菌量約為3%,菌懸液在580 nm處的吸收度為約1.0,試驗結果較為理想。

　　2.3 準確度與精密度考察

　　2.3.1 回收率試驗選擇 90%、100%、110%三點(diǎn)進(jìn)行回收率試驗。①90%樣品溶液制備:分別精密吸取上述標準品溶液(1 000 U/mg)4.5、9.0 ml,用pH=7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋成高低濃度分別為9、18 U/mg的抗生素溶液。②100%樣品溶液制備:分別精密吸取上述標準品溶液(1 000 U/mg)5、10 ml,用pH=7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋成高低濃度分別為10、20 U/mg的抗生素溶液。③110%樣品溶液制備:分別精密吸取上述標準品溶液(1 000 U/mg)5.5、11.0 ml,用pH=7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋成高低濃度分別為11、22 U/mg的抗生素溶液。分別取上述溶液,按照濁度法操作,結果回收率分別為100.51%、100.27%、100.34%。

　　2.3.2 重復性試驗 取同一批樣品,配制6份供試品溶液,進(jìn)行測定,于1 d內完成,結果6份供試液效價(jià)均值為562 U/mg,RSD為5.8%。提示該抗生素溶液不宜久放,時(shí)間因素對測定結果影響較大,試驗時(shí)溶液應臨用新制。

　　2.3.3 樣品含量測定取硫酸小諾霉素標準品及樣品適量,精密稱(chēng)定,用滅菌水制成1 000 U/mg的溶液,分別精密吸取此液適量,用滅菌磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)稀釋制成10、20 U/mg濃度的高低劑量溶液,高低計量劑間比為2∶1,分別精密量取上述溶液各1.0 ml,置滅菌比色管中,各6管,分別加入3%大腸埃希菌液培養基9.0 ml,立即搖勻,在濁度測定儀中培養3.5 h。按“2.1.6”項下方法測定。陰性對照:pH=7.0磷酸鹽緩沖液1.0 ml,加9.0 ml未接種實(shí)驗菌的培養基。分別用濁度法與管碟法的二劑量法對5批硫酸小諾霉素原料藥進(jìn)行測定,并測定結果進(jìn)行比較(n=5),結果見(jiàn)表1。

　　表 1 濁度法與管碟法的測定結果比較

　　原料藥標示效價(jià):574 U/mg

　　對樣品及原料藥用比濁法和管碟法測得的含量和可信限率FL(%)進(jìn)行t檢驗,結果無(wú)顯著(zhù)性差異(P>0.05),比濁法的可信限率優(yōu)于管碟法[4]。

　　3 討論

　　試驗菌必須具有穩定性,對于實(shí)驗來(lái)說(shuō),它是決定性因素,因此在菌懸液的制備過(guò)程中,需嚴格控制菌種斜面的質(zhì)量和菌種培養的溫度和時(shí)間。培養溫度為37℃,時(shí)間應不少于22 h,菌液應質(zhì)細、均勻[5]。

　　試驗菌的穩定性實(shí)驗用培養基必須色澤淺、質(zhì)澄清,靈敏度應高,應能保證試驗菌生長(cháng)良好。特別要控制pH值,若pH值不適合,試驗菌生長(cháng)緩慢,在規定時(shí)間內形成的濁度達不到要求。若增加培養時(shí)間,則實(shí)驗精密度隨之較差[6]。

　　試驗中嚴格防止微生物和抗生素的污染相對而言,微生物污染對濁度法的影響要比管碟法要大,濁度法培養時(shí),比色管必須潔凈,其他抗生素或污染菌與試驗菌混合在一起同時(shí)生長(cháng),這樣將導致生物反應紊亂,造成同濃度各管的吸收度差別增大,可信限率顯著(zhù)增高,影響效價(jià)測定結果的精密度與準確度[7-8]。

　　試驗中溫度對結果的影響較大,應保持溫度恒定、均勻,各管如受熱不夠均勻,則平行試驗的結果不好,所以各管應隨機放置,以消除局部溫度不均勻對細菌生長(cháng)的的影響。定時(shí)振搖可使細菌均勻生長(cháng),上下濁度一致,縮短實(shí)驗時(shí)間。

　　試驗中培養時(shí)間控制得是否準確也非常重要,試驗時(shí)各管最好按一定時(shí)間間隔加入含菌培養基,測量時(shí)也按同一時(shí)間間隔測量,控制試驗偏差較小在較小的范圍內(±5%)。

　　實(shí)驗表明,采用濁度法與管碟法測定硫酸小諾霉素原料,結果一致,濁度法操作方便,重現性較好,可以用于硫酸小諾霉素原料的效價(jià)測定。本次研究還考察了濁度法測定硫酸小諾霉素制劑效價(jià)的可行性,結果表明濁度法完全可以用于測定該品種片劑,實(shí)驗中若將高低濃度抗生素溶液過(guò)濾,則可減小輔料的影響,結果的可信限率將更低。

　　[參考文獻]

　　[1]國家藥典委員會(huì ).中華人民共和國藥典[S].二部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:附錄82.

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　　[8]姜建國,高燕霞,韓斌.濁度法測定磷霉素鈣膠囊的效價(jià)[J].中國藥師,2008,11(11):1271-1272.

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