濁度法測定12-去羥基阿奇霉素的效價(jià)

來(lái)源：http://www.thesierramadre.com/ 作者：余氯檢測儀 時(shí)間：2019-01-04

　　【摘要】 目的 建立濁度法測定12.去羥基阿奇霉素效價(jià)的方法。方法 以肺炎克雷伯菌為試驗菌，加菌量0.6%~1.0%(V/V)，37℃±0.5℃培養4 h左右測定。結果 抗生素線(xiàn)性濃度為2.0~10.0 U/ml，二劑量法原料的平均回收率為101.2%，RSD為2.2%(n=9)。結論 本方法靈敏，快速，影響因素較少，可作為測定12.去羥基阿奇霉素的效價(jià)的方法。

　　【關(guān)鍵詞】 效價(jià);濁度法;12.去羥基阿奇霉素

　　12-去羥基阿奇霉素是由紅霉素C為原料，通過(guò)化學(xué)合成的方法合成的。本藥物屬廣譜抗菌藥， 對大多數革蘭陰性細菌以及細胞內病原菌、支原體和衣原體等有較好的抗菌活性，對革蘭氏陽(yáng)性細菌也有一定的抗菌活性。其抗菌活性較阿奇霉素為強。

　　本藥物屬于新藥，目前尚無(wú)含量測定方法。本文建立了濁度法測定12.去羥基阿奇霉素效價(jià)的方法。通過(guò)對12.去羥基阿奇霉素用比濁法測定其效價(jià)的研究，即可直觀(guān)反應藥物的抗菌活力，又可在檢測當天獲得實(shí)驗結果。

　　1 儀器與試劑

　　CBZ.1抗生素光度比濁法測量?jì)x、石英培養杯(厚度1 cm)，北京潮聲公司。

　　肺炎克雷伯菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44 103]，由中國藥品生物制品檢定所提供。

　　阿奇霉素標準品(批號：130352.200405含量：936 U/mg)由中國藥品生物制品檢定所提供。12.去羥基阿奇霉素(河北省藥品檢驗所自主合成)。

　　抗生素檢定培養基Ⅲ號(pH7.8，批號060403)由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供(中國藥品生物制品檢定所監制);滅菌0.9%氯化鈉溶液和磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)均按中國藥典2005年版二部附錄配制。

　　2 方法與結果

　　2.1 一劑量法

　　2.1.1 菌液的配制 取肺炎克雷伯菌的營(yíng)養瓊脂斜面培養物，接種于營(yíng)養瓊脂斜面上，在35℃~37℃培養18~22 h，臨用時(shí)，用0.9%滅菌氯化鈉溶液洗下;取新鮮的菌懸液適量，加12%甲醛液1 ml殺滅，加生理鹽水做適當的稀釋?zhuān)沟闷湓?80 nm波長(cháng)處的吸收值為1.0，記錄其稀釋所用的生理鹽水的毫升數和1 ml 12%甲醛液的總毫升數，再將原菌液按此比例稀釋?zhuān)礊樵囼灳?。取試驗菌?.6~1.0 ml加至培養基100 ml中，搖勻，為實(shí)驗菌液。

　　2.1.2 溶液的配制 標準品溶液取阿奇霉素標準品適量，精密稱(chēng)取，加乙醇溶解并用水稀釋成1 000 μg/ml的溶液，作為儲備液備用;精密量取儲備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)進(jìn)一步稀釋成2、4、5、8、10 U/ml的標準品溶液。

　　2.1.3 培養與測定 取標準品溶液1.0 ml，加入滅菌培養管中，再加入實(shí)驗菌液9.0 ml，置抗生素比濁法測量?jì)x內，于37℃培養。另取稀釋溶劑1.0 ml，加空白培養基9.0 ml，混勻，作為空白對照，儀器在線(xiàn)于530 nm的波長(cháng)處測定各管肺炎克雷伯菌對數生長(cháng)期內不同培養時(shí)間下的吸光度值(A)。根據量反應平行線(xiàn)原理計算供試品的效價(jià)值。

　　2.2 二劑量法

　　2.2.1 溶液的配制 ①標準品溶液精密量取阿奇霉素標準品儲備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)稀釋制成4.0 U/ml和8.0 U/ml的標準品溶液;②供試品溶液取12.去羥基阿奇霉素適量，加乙醇溶解并用水稀釋成1 000 μg/ml的溶液，作為儲備液備用;精密量取12.去羥基阿奇霉素儲備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)稀釋制成4.0 U/ml和8.0 U/ml的供試品溶液。

　　2.2.2 菌液的配制 同2.1.2項下制備方法。

　　2.2.3 培養與測定 同2.1.3項下方法。

　　2.3 線(xiàn)性與范圍的測定 照抗生素微生物檢定一劑量法測定，并以各組濃度標準品溶液所致菌液吸收度的值對溶液對數濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，繪制標準曲線(xiàn)，計算回歸方程及相關(guān)系數分別為：

　　回歸直線(xiàn)方程 Y=bX+a=.0.471 5 X+0.832 6相關(guān)系數r=0.995 5。

　　結果表明：采用標準品溶液進(jìn)行一劑量法試驗，在2~10 U/ml的濃度范圍里，呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

　　2.4 回收率試驗 精密稱(chēng)取阿奇霉素標準品及一批已知含量的12.去羥基阿奇霉素原料樣品，精密稱(chēng)定，加乙醇溶解并用水稀釋成800、1 000、1 200 U/ml的溶液，作為儲備液備用;精密量取儲備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)稀釋制成3.2和6.4 U/ml、4.0和8.0 U/ml、5.0和10.0 U/ml的供試品溶液。在上述條件下測定，測得回收率結果為平均加樣回收率為101.2%，RSD為2.2%(n=9)。

　　2.5 重復性試驗 用已知含量的12.去羥基阿奇霉素樣品一批，共測定6次，結果平均含量為950 U/mg，RSD為1.8%。

　　2.6 穩定性考察 主要考察了抗生素溶液，即貯備溶液和測定溶液穩定性對測定結果的影響。

　　結果表明：本品的濃溶液和點(diǎn)樣用稀溶液放置冰箱保存可穩定2 d，完全可以滿(mǎn)足實(shí)驗的需要。

　　2.7 專(zhuān)屬性考察 采用回收率試驗進(jìn)行驗證，結果見(jiàn)2.4。

　　2.8 樣品測定 按上述濁度法測定法的二劑量法，進(jìn)行試驗，結果見(jiàn)表1。

　　3 討論

　　3.1 測定條件的選擇

　　3.1.1 實(shí)驗菌、培養基及加菌量的選擇 12.去羥基阿奇霉素為廣譜抗生素，對大多數革蘭氏陰性細菌敏感，對革蘭氏陽(yáng)性細菌也有一定的抗菌活性。曾選用金黃色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌同時(shí)作實(shí)驗，發(fā)現肺炎克雷伯菌對于本品種來(lái)說(shuō)更為敏感。因此，本研究選擇肺炎克雷伯菌作為實(shí)驗菌。培養基采用國內外藥典通用的抗生素檢定培養基Ⅲ號，pH為7.0，滅菌后為澄清的液體培養基，適合肺炎克雷伯菌生長(cháng)。

　　菌液濃度：比濁側定時(shí)，菌液過(guò)濃亦可使濃度.吸收度不成直線(xiàn)關(guān)系;但菌液濃度過(guò)稀，則讀數偏低，誤差增大。一般控制吸收度讀數在0.3~0.7較為適宜。

　　3.1.2 測定時(shí)間的選擇 采用試驗菌的不同傳代次數(3、4、5代)及不同加菌量(0.6~1.0%)，以不同抗生素濃度試驗，觀(guān)察試驗菌的生長(cháng)曲線(xiàn)。發(fā)現，在4 h左右可達到所需濃度范圍(即培養一定時(shí)間后，吸光度應在0.3~0.7，劑距為2的相鄰劑量間的吸光度差值不小于0.1)。

　　3.1.3 時(shí)間的一致性 主要是使每管的培養時(shí)間相等，實(shí)驗時(shí)在試管中加入含試驗菌液的培養基后，應立即加入標準品溶液和供試品溶液，混合均勻。必要時(shí)可先將培養基冷卻至2℃~4℃左右，再接種菌種，并在此溫度下，將含菌培養基加至各試管中，可避免加注試管先后的誤差。培養終止時(shí)原應將各管同時(shí)放入冰浴中，并盡快加入甲醛溶液滅活，使各試驗管的培養時(shí)間一致，現采用儀器在線(xiàn)測定，則不需此項操作。

　　3.2 濁度法具有快速(試驗過(guò)程3~4 h，加上其他操作，可在當天獲得結果)，易于操作，結果用儀器測定，便于自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn);更重要的是采用液體培養基，消除了多組分抗生素在固體培養基中擴散不同的影響，使得試驗的靈敏度高，精密度和準確度都較瓊脂擴散法好。但濁度法對試驗儀器的性能及試驗器具的要求較高(如：培養溫度要求一致，比色管的清潔等)，另外，任何影響液體培養基內微生物生長(cháng)的因素都會(huì )影響抗生素效價(jià)的測定，這是其缺點(diǎn)。因此，隨著(zhù)大量單組分抗生素采用HPLC法測定含量，濁度法將成為不易采用HPLC法的抗生素和多組分抗生素效價(jià)測定的主流。12.去羥基阿奇霉素。

　　參考文獻

　　1 國家藥典委員會(huì ).中華人民共和國藥典(2005年版二部).化學(xué)工業(yè)出版社，2005:82.

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